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细胞骨架染色试剂盒采用丝状肌动蛋白F-actin荧光染色法染色细胞骨架，可以用于各种动物、植物的细胞骨架染色。本试剂盒采用荧光探针FITC标记的鬼笔环肽(Phalloidin)标记骨架蛋白F-actin。FITC为绿色荧光探针。
细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。细胞骨架肌动蛋白是球形的、大约42kd的蛋白，在几乎所有的真核细胞都存在。这是一个非常保守的蛋白，在各物种差异不超过20%。肌动蛋白是两种细胞内丝状结构的构成单体：微丝(三种主要的细胞骨架成分之一)，以及细肌丝(是肌肉细胞收缩复合物的一部分)。肌动蛋白参与很多重要的细胞功能，包括肌肉收缩，细胞移动，细胞分裂和胞质分裂、小泡和细胞器的运动、细胞信号，以及细胞连接和细胞形态的保持和建立。
显示细胞骨架的常用方法有两种：骨架蛋白染色法和免疫荧光染色法。骨架蛋白染色法具有简单易行的特点，但不能区分骨架蛋白的组成，有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，常用于骨架形态及完整性研究；免疫荧光染色法可特异显示骨架蛋白，是用一种微丝解聚抑制剂，它与肌动蛋白纤丝有强亲和作用，使肌动蛋白纤丝稳定，抑制解聚，且只与F-actin结合.因此，利用荧光标记可以清晰显示细胞中微丝的形态，利用荧光显微镜对荧光标记的细胞骨架进行观察，可以得到清晰的实验结果。具有更普遍的应用意义。
没有荧光观察条件，需要常规骨架蛋白染色试剂盒，可以选择我公司产品货号HR8337的试剂盒。
鬼笔环肽(Phalloidin)是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)的环状七肽毒素，以高亲和力(Kd=20 nM)选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白(Actin)抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15?，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白(Actin)的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。鬼笔环肽(Phalloidin)的结合阻止丝状肌动蛋白(微丝)的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度(CC)降至＜1μg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。
用荧光标记的鬼笔环肽染色可以清晰地显示细胞中微丝的分布。将鬼笔环肽注射到细胞中同样能阻止细胞运动，可见微丝的功能依赖于肌动蛋白的组装和去组装的动态平衡。鬼笔环肽这种性质使得它们成为一种探索F-Actin分布的的良好工具，可以通过用带有各种荧光探针的鬼笔环肽结合Actin丝状物在荧光显微镜下观察来实现。鬼笔环肽的荧光衍生物已经被证明在活体或固定细胞内定位Actin丝状物和在体外观察actin丝状物的实验中起重要作用。
FITC-Phalloidin染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。FITC-Phalloidin可以广泛用于固定、通透性细胞，但也可以进入活细胞中。

组份	100T	200T
组分A：FITC-Phalloidin染料	100μL	200μL
组分B：染料稀释液(10×)	10mL	20mL

染料-20℃避光保存；稀释液2～8℃保存，有效期1年。
注：
● 染料短期2周内可以2～8℃保存，长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。


激光共聚焦/荧光显微镜，离心机，载玻片和盖玻片，PBS，固定液4%多聚甲醛，纯水，透化液0.05～0.1% Triton X-100(溶于PBS)，100 nM DAPI溶液，盖玻片周围密封液(如透明指甲油)


● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
● 标本应新鲜，且未受其他化学物品污染。
● 应根据组织、细胞类型不同调整通透时间。
● 动物细胞样本细胞通透剂处理时间很关键，如果处理时间太短，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂，造成细胞空洞。通透时间应控制在10～35分钟。需根据预实验的染色结果确定最佳通透时间。一般预实验起始通透时间植物样本为10分钟，动物细胞样本5分钟。
● 染色液染色时间根据预实验结果可以进行调整，颜色过浅可延长染色时间，颜色过深可缩短染色时间。
● 洗片时动作要轻柔，避免将细胞从玻片上洗掉。
● 染色后用水充分洗涤，自然晾干即可，不能用常规的酒精梯度脱水方法。
● 不同样本的操作方法稍有差异，请根据具体样本操作。
● 下面以细胞爬片/涂片样本染色为例，滴加相应的试剂到玻片上，加样量以覆盖样本即可。如果是植物切片等，也可以在离心管、试管等里面进行洗涤、通透、染色等操作，最后置载玻片上观察即可。


1.染色工作液配制：
将染料稀释液(10×)用纯水10倍稀释成1×染料稀释液备用。根据样本数量，用1×染料稀释液将FITC-Phalloidin荧光染料100～200倍稀释，配制成染色工作液。
注：
● 建议收到产品后，根据使用量，对母液进行分装，-20℃避光冻存，一年稳定。
● 开始实验前，使用1×稀释液稀释染料储存液到需要的工作浓度。
● 工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度。起始测试工作浓度可以用150倍稀释。
● 工作液现配现用。
2.将制作好的细胞爬片/细胞涂片用37℃预热的1×PBS(pH7.4)清洗2次。
3.细胞固定：滴加溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定5分钟，立即用PBS洗涤3次。
注：
● 避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。
● 样本多时可用容器装好PBS分别浸泡洗涤3次，样本较少时也可加500μL PBS到玻片上进行洗涤。
● 此步为动物细胞样本的步骤，植物切片类不需要做此步骤，第2步洗涤完直接进行第4步通透即可。
4.室温条件下，透化细胞：滴加0.05～0.1% Triton X-100/PBS溶液透化处理样本，处理3～5分钟。
注：
● 经Triton破膜过度后，FITC-Phalloidin可能对细胞核有非特异性染色，注意通透时间。
● 该步骤可以省略，因为FITC-Phalloidin分子量比较小，多聚甲醛固定后细胞膜产生的部分孔洞可以让FITC-Phalloidin进入细胞。
5.室温条件下，用PBS洗细胞3次，自然晾干。
6.室温条件下，染色：用适量细胞骨架染色液工作液，覆盖住玻片上的细胞，室温避光孵育40分钟-更长时间，最长可以过夜染色，一般40分钟～1小时即可。
注：
● 可以在染色工作液内加入终浓度为1% BSA，能起到降低背景的作用；或者在染色前用含1% BSA的PBS液室温封闭细胞20～30分钟。
● 孵育过程中为了避免溶液挥发，可将玻片转移到一个密封的容器内。
7.用PBS洗细胞3次，每次5分钟。自然晾干。
8.使用适量浓度为100nM的DAPI溶液对细胞核进行复染，约30秒即可。
注：
● 此步骤为选做步骤，可以不进行核复染。
● 也可以根据需要选择其它颜色的核染料。
9.用PBS洗细胞。
10.用激光共聚焦显微镜观察。FITC-Phalloidin激发/发射波长495/513nm和DAPI激发/发射波长359-364/454～461nm。
注：
● 或封片后观察。
● 标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做染色分析。
结果：
细胞骨架纤维呈绿色。细胞核呈蓝色(如果DAPI复染)。
细胞核和细胞质表面分布许多排列不规则的纤维束，走向清晰。
注：
● 如果见到部分细胞骨架纤维并非呈纤维状，而是呈串珠状或颗粒状，可以进一步优化通透、染色时间、染液浓度等条件。
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